空斑试验：定量病毒的金标准

 

原标题：空斑试验：定量病毒的金标准

测试未知样品中含有多少感染性病毒对于从事病毒相关工作的人来说是非常重要的。但是如何定量病毒呢？一种有效的方法就是“空斑试验”，它是专门用来测定感染性病毒颗粒的方法。这个试验是将病毒悬液滴加到相应的单层宿主细胞中，然后覆盖半固体培养基，从而限制病毒的大面积感染扩散，仅感染邻近细胞，而感染并死亡的细胞则会脱落形成斑块。空斑试验是病毒学中最成熟和最可靠的方法之一，非常值得我们进一步学习。

01 病毒侵染细胞形成空斑

空斑试验需要培养容易被目标病毒感染的宿主细胞。首先将细胞接种到它们可以粘附生长的平皿上，放置CO2培养箱培养至无间隙的单层细胞。之后将病毒样品进行梯度稀释，将稀释液滴加到细胞培养皿或孔中进行1~2 h孵育。在孵育阶段病毒可以附着在宿主细胞上，之后移除接种物。然后用含维持培养基的半固体琼脂加入到培养皿或孔中，形成半固体覆盖物。感染的病毒粒子进入宿主细胞并大量复制，随后会触发细胞释放出子代的病毒粒子。而半固体培养基限制了病毒粒子的运动，因此新产生的病毒只能感染邻近的细胞。如果病毒杀死感染的细胞，死亡（或垂死的）细胞会脱落，并通过裂解或其他方式在单层中形成一个斑块。这个没有细胞的斑块部分被称为空斑，其在整个单层细胞上看起来像圆形的斑点。

待空斑生长至肉眼可见，然后用甲醛固定细胞结构，同时杀死细胞和病毒。添加可以使细胞染色的染料进行对比，使空斑更容易被看到。结晶紫将细胞核染成紫色，而无细胞的部分则为透明。这个试验有个前提，粘附在平皿上的细胞被假设为未受到感染的细胞，而明显的空斑则假设为由病毒感染细胞并引起死亡导致的。这就是为什么必须将病毒稀释液添加到无间隙的单层细胞中，以免后续观察时被误认为空斑而造成计数误差。

02 病毒滴度确认：PFU/ml

对原液样品进行多个梯度稀释，以确认可计数的空斑的稀释度。在最低稀释度下，过多的感染性病毒粒子会破坏大片的单层细胞，或者产生过多且重叠的无法识别的空斑。在最高稀释度下，有可能根本没有空斑。在最佳稀释度下，对空斑进行计数以确定原液样品的滴度，通常报告为每毫升的空斑形成的单位数(PFU/ml)。

可以根据加入细胞中的试样体积和稀释度，通过简单计算即可推算出样品原液滴度。例如：如果向细胞中加入0.1 ml的10-5病毒稀释液时，可计数38个空斑，则未稀释原液的滴度为3.8×107PFU/ml。为了获得可靠的滴度，每个样品稀释液接种3个复孔。

设计这个试验的预期就是每个空斑都是由单个传染性病毒颗粒扩增而引起的。因此，PFU/ml被认为是每毫升感染单位数(IU/ml)的量度，但需要注意的是，稀释液得到的空斑数与感染性颗粒往往并不是一一对应的。此外，需要注意的是样品滴度与试验的测定条件有很大关系，如宿主细胞类型、pH值和培养基类型等，关键参数的改变，都可能会导致滴度的几个数量级的差异。

03 空斑计数的挑战

细胞生长表面的大小和形式是也是进行空斑实验的关键因素，常见的选择包括较大的单个培养皿或包含多个大小相同的较小独立空间的多孔板。我们通常在6孔平板中进行空斑试验，每个孔的直径约为35mm，可识别超过200个不同的斑块。

我们可以对平皿进行成像，然后使用计算机软件对图像进行分析。使用处理图像和计数空斑的专业自动化仪器可以大大地提高处理效率，这类仪器可以识别更小的空斑，从而缩短孵育时间，并使得使用高通量培养皿（如96孔板）来处理样品变得可行。

虽然使用专业仪器来分析可见空斑确实具有一些优势，但是实验室用的最多的还是传统的肉眼计数空斑的方法。目前该检测方法存在一些局限性，可见空斑的形成需要培养很长时间，尤其是当需要通过肉眼进行计数时，不同的病毒，可计数的空斑通常需要4~10天才能形成。当使用低通量培养皿处理样品以及需要计数数千个空斑时，这个检测方法会费时费力。实验人员计数以及实验操作都会造成结果的差异，机器计数虽然更快、更稳定，但机器并不能总是准确无误的识别出空斑。

04 病灶形成试验（Focus forming assay，FFA）

空斑试验的最大局限性在于并非所有病毒都会形成空斑。一些病毒不会杀死它们的宿主细胞，因此不会在单层细胞中产生空斑。在这种情况下，病灶形成试验可以检测被感染的细胞群，称为病灶。该试验类似于空斑试验，以产生局部感染细胞簇，但这些病灶是使用对病毒特异灵敏的抗体来检测的。将荧光分子连接到抗体上可以通过荧光显微镜观察，或者用酶标记抗体（如辣根过氧化物酶），该酶可以切割底物产生可检测的有色产物。通过可视化，就可对病灶进行计数，并将滴度报告为每毫升的病灶形成单位数(FFU/ml)。病灶形成试验也可用于形成空斑的病毒，只需培养很短时间，在形成可见空斑之前就可以检测到病灶。

当然该检测方法也存在很大的缺点，获取检测抗体会大大增加病毒定量的成本。此外，如果没有合适的抗体，就不能选择病灶形成试验方法，例如新出现的病原体往往是没办法用这个方法进行测试的。

05 病毒滴度测定的其他方法

与感染法测定病毒滴度相比，电子显微镜可以直接计数单个病毒颗粒。当然也可以使用实时荧光定量PCR、Western Blot、ELISA和流式细胞术等方法测定病毒组分（如DNA、RNA或蛋白质）。然而，与空斑和病灶形成试验不同，这些方法并不能测定病毒的感染性。通常病毒样本中包括两部分，能进入细胞进行扩增的感染性病毒粒子和无活性病毒粒子。

因此，通过电子显微镜观察病毒或通过ELISA定量病毒蛋白并不能确定感染性病毒的相关信息。相反，像空斑试验这样的感染性测定可以检测感染性病毒，但并不能检测总病毒颗粒。

在哺乳动物细胞的培养方法地建立起来之前，动物病毒必须通过用病毒样品的系列稀释液处理试验动物或鸡胚来量化。然后将死亡或其他疾病迹象用作感染的标志。接种多个稀释度的稀释液有助于确定仅感染一些动物或鸡胚的稀释度，低稀释度会感染所有受试者，而高稀释度则不会感染受试者。然后可以计算出感染50%受试者的病毒稀释度。这种类型的终点稀释试验现在更常用于培养细胞，称为半数组织培养感染剂量。虽然TCID50测定容易操作而且能提高检测通量，但空斑试验可以提供更准确的滴度。

06 永恒的空斑试验

尽管空斑试验有着悠久的历史，但空斑试验拒绝成为历史的遗物。大约在1917年，Felix dHerelle建立了第一个版本的空斑试验法，定量了一种细菌病毒（噬菌体）。在1950年初期，诺贝尔奖得主的Renato Dulbecco和他的同事Marguerite Vogt改进了噬菌体空斑试验法来量化动物病毒，他们的方法经受住了时间的考验。哺乳动物细胞培养技术不断的发展使该实验在细胞层面上应用成为可能，该技术使得终点稀释法试验从活体动物转移到多孔板中的细胞中来。自此之后，虽然科技的进步催生了无数的病毒学新技术，但空斑试验仍然是一种独特的定量病毒的金标准。返回搜狐，查看更多

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